流式细胞仪的工作原理

流式细胞术是一种基于激光的技术，可快速分析液体样品中的细胞(或颗粒)，获得有关理化特性的精确信息。该技术涉及将细胞用荧光标志物标记，并在细胞悬浮于溶液中时使其逐个通过激光器(或多个激光器)1。细胞与激光束之间的相互作用产生散射光和荧光信号，由检测器接收这些信号，将其转换成电信号，然后通过计算机进行分析以确定细胞信息。这种强大且高度精确的技术可以确定细胞大小、计数、健康状况和周期状态等细胞特征，且具有包括癌症研究、免疫学、血液学、疾病诊断等多种应用。

流路、光学元件和电子元件

流式细胞仪的机械部件可分为三个不同的部分：

流路部分包含鞘液，作用是将细胞从样品管输送至流通池，穿过激光，然后对鞘液进行分选或丢弃。

光学元件部分由激发光源(激光器)、收集物镜、二向色镜和检测器组成。这些组件负责产生激光束，将光转向不同的检测器，并检测来自所照亮的细胞的光和荧光信号。

电子元件部分将光和荧光信号转换成数字信号数据集，由计算机读取并进行分析。

流路：样品提升步骤

流路系统将样品中的细胞(或颗粒)制备成逐一通过流式细胞仪。流式细胞术始于荧光标记细胞的单细胞悬液。当样品进入仪器时，先进入流通池中并被鞘液包围1。一种称为流体力学聚焦的现象(细胞被组织成单文件流的机制，可穿过流式细胞仪)发挥作用。生成细胞的该单文件流是获取有关样品中每个细胞信息的关键步骤3。观测点观测点(也称为激光拦截)是来自激光束的光截获流路系统逐个穿过的单个细胞的点1。当激光照射细胞时，光在细胞边缘周围衍射，产生的光散射约等于细胞周长。这种光散射被称为前向散射光，因为它是被平行于入射激光束放置的收集物镜(光电倍增管或光电二极管)接收。前向散射光提供有关细胞大小的信息。

在相同的时刻，照射细胞的激光也被细胞的内部特征反射。这种反射光被称为侧向散射光，因为它是被垂直于入射激光束放置的收集物镜接收的。侧向散射光可提供有关细胞粒度和复杂性的信息，并确定细胞类型(例如粒细胞将产生比淋巴细胞大得多的侧向散射光信号)。

经收集物镜聚焦后，激光被二向色镜反射，该二向色镜将特定波长的光通过光学滤光片导向合适的检测器(例如，前向散射器、侧向散射器或荧光检测器)。

除确定细胞大小、复杂性或粒度以外，还可以在观测点进行关于细胞内在和外在特征的分析，例如测定特定蛋白质表达或核酸含量。这些可使用光激发核酸染料或荧光探针进行评估。对于蛋白质表达分析，荧光探针通常是具有共价连接荧光染料的抗原特异性抗体。例如，为评估表达细胞外蛋白质的细胞，可以应用荧光素偶联抗体以与目标蛋白质特异性结合。当表达目标蛋白质的细胞通过观测点时，荧光探针被激发并发出荧光信号，这些荧光信号被检测器接收。无荧光结合抗体的细胞不会产生该荧光信号。这样可以确定细胞是否表达目标蛋白质。

为表征混合细胞群(例如在人类血液样品中)，可以使用一种称为多色流式细胞术的技术。混合物中的每种细胞类型均可使用特定的荧光探针进行标记。然后，每个荧光探针将在观测点产生不同颜色的荧光信号，从而能够确定不同细胞类型的细胞群。该信号通过侧向散射收集物镜1。由激发的荧光团所产生的荧光呈有限光谱的形式，而非具有特定的波长。因此，二向色镜将来自该信号的特定波长的光反射到放置在荧光检测器前面的光学滤光片上，可以准确限定波长。

细胞亚群也可以使用一种称为荧光激活细胞分选 (FACS) 的特殊类型的流式细胞术进行物理分离。该分离过程基于细胞产生的光或荧光信号将细胞的异质混合物分为几组。这有助于从混合物中分离特定细胞类型的群体，以用于纯化目的或进一步分析。

数据检测器以电信号的形式采集由观测点的细胞发出的光和荧光信号，将其转换成可由计算机读取的数字信号。专用计算机软件将这些数字信号转化为代表荧光探针及其颜色存在的数据点，可用于确定细胞信息。可同时测量多种不同的参数，以确定有关每个细胞的详细信息。当对整个样品进行重复分析时，软件将整合数据，最终根据这些参数区分细胞组。传统的流式细胞术分析可能涉及在代表细胞群的一组数据点周围绘制一个区域(一种称为“门控”的方法)，可以选择特定的细胞群进行进一步分析。例如：辅助性 T 细胞可首先通过 CD3+ 和 CD4+ 表达从一组免疫细胞中得到鉴定，并可进行门控。然后，可通过分析用于表达活化标志物(如 CD25)的门控细胞来确定该细胞群中的细胞活化。

应用

流式细胞术在多个学科领域中有众多的应用，常用于基础研究、临床实践和临床试验中。

癌症研究流式细胞术已被证明是癌症研究中不可或缺的工具。该技术最初应用于癌症研究中，研究 DNA 含量以确定细胞倍性，并确定人类实体癌类型中的细胞增殖。随着单克隆抗体和新荧光染料的发现，该技术从此在该领域取得了进展。流式细胞术还可以与数字显微镜结合，以成像流式细胞术的形式在癌症研究中生成高通量的定量数据

目前，流式细胞术用于：

在癌症诊断中筛选异常 DNA 含量

检测 RNA(对于血癌)8和特异性标记的表面标志物(对于淋巴细胞肿瘤和髓系肿瘤)

检测是否存在 DNA 整倍体和 S 期肿瘤细胞，以确定恶性肿瘤

自噬评估

定量分析癌症治疗的治疗和副作用